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基于尿样代谢组学的中药药效及毒性研究进展

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    作者:唐丹丹,袁圣钧,张男,赵宇辉,魏锋,赵英永

    摘要:代谢组学主要是通过分析生物体受到外界刺激后产生的相对分子质量低的内源性代谢产物来推断生物体的生理病理状态。代谢组学研究的整体、动态特点与中医药的整体和辩证论治特点相吻合,代谢组学已应用于中药现代化研究,推动了中医药的发展。本文查阅国内外有关代谢组学在单味中药及中药复方中的药效以及毒性方面研究的文献,总结了代谢组学在中药现代化研究中的成果,为该方面的研究提供参考。


     中药的疗效早已在中医几千年的临床治疗疾病的实践经验中得以证实,特别是在一些慢性疾病的治疗中发挥着西药不可替代的作用。中药治病防病以中医药理论为指导,并有君臣佐使的配伍原则。复方中多味药的配伍应用使得中药复方的研究既需要研究各单味中药,又需要研究各单味中药之间的配伍及其协同作用等。因此,中药复方药物的研究更为复杂和困难,单纯分析还原的研究方法很难解读中药复杂理论体系的科学内涵。代谢组学的全局、动态观念与中药的整体调节、系统观、辩证论治理论相通,将代谢组学方法和技术应用于中药的现代化研究,有可能使以实践经验为基础的中药治病向以科学的方法和标准为基础的现代化中医药转变。

    1. 代谢组学

    代谢组学(metabonomics或metabolomics)是20世90年代末期迅速发展起来的一门新兴学科,是系统生物学(system biology)研究的重要组成部分,1999年,Nicholson教授首次提出代谢组学概念。代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定量分析,从而定量描述生物整体内源性代谢物质及其对内因和外因变化应答规律的科学。代谢组学有2个中心任务:一是对内源性代谢物质的整体及其动态变化规律进行检测、量化和编录;二是确定此变化规律和生物过程的有机联系。根据研究对象和研究目的不同,代谢组学的研究又可分为几个不同的层次:(1)代谢靶标分析(metabolite target analysis),对某一靶蛋白和/或其产物分析,研究其在代谢应答中的变化,并与已知的代谢途径相关联,得出外源性物质的刺激对该代谢途径的效应;(2)代谢轮廓分析(metabolic profiling analysis),采用针对性的分析技术,对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定;(3)代谢指纹分析(metabolic fingerprinting analysis),不关注特定的组分,对细胞外、细胞内全部代谢物进行高通量的定性分析,实现样品的快速筛选分类;(4)非靶向代谢组学分析,对生物系统全部代谢物进行综合分析。

    完整的代谢组学研究流程包括前期的样品制备,中期的代谢产物分离、检测与鉴定以及后期的数据分析与模型建立3个部分。其样品主要是尿液、唾液、血浆、血清以及细胞和组织提取液。样品的制备主要包括用水或有机溶剂甲醇、乙腈等的提取。分析之前,样品常先用固相萃取、固相微萃取或亲和色谱等预处理。常见的分析方法有高通量、高灵敏度与高精确度的质子核磁共振(1H NMR)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等现代分离分析技术。代谢组学研究的关键在于通过对大量原始数据的统计学处理,获得数据中潜在的生物学意义。代谢组学中常用数据分析方法有:主成分分析(PCA)、簇类分析、非线形映射等非监督方法和最小二乘-判别分析(PLS-DA)、人工神经网络等监督方法。

    2. 代谢组学与中药活性研究

    代谢组学是研究在新陈代谢过程中生物体内代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质的科学。生物体许多不能从基因组、蛋白组体现出的变化可以通过代谢组体现,基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大。运用代谢组学研究中药,对认识中药的整体药效作用、中药活性成分、中药毒副作用等都具有重要的科学意义。

    2.1利用代谢组学研究单味中药药效作用机制

    中药活性成分指中药中发挥药效作用的化学成分,是阐明中药作用的关键。大量中药研究实践证明,单一化学成分不能阐释中药的功效和作用机理,只有那些直接或间接发挥生物学作用的中药化学物质才可能是中药活性成分。利用代谢组学研究中药活性成分的药效作用机制,可以在一定程度上阐明中药的药效物质和作用机制,单味中药尿样代谢组学研究常见生物标示物见表1。

    Zhao等利用UPLC-QTOF/HDMS结合代谢组学平台研究了茯苓皮对慢性肾病的作用,结果发现茯苓皮主要通过以下几种机理改善大鼠肾损伤:(1)腺嘌呤代谢。茯苓皮可以增加大鼠尿样中腺嘌呤代谢中间产物2,8-二羟基腺嘌呤的排泄并降低其在肾小管的结晶;(2)氨基酸代谢。茯苓皮可以使尿中吲哚三羧酸和黄尿酸浓度下降从而改善色氨酸代谢,还可以通过尿中3-氧-甲基多巴的上调恢复芳香族氨基酸的功能而对腺嘌呤诱导的慢性肾病大鼠起到治疗作用。近年来肾病对人类健康的危害越来越严重,肾病的研究受到广泛关注,Li等研究淫羊藿对氢化可的松诱导的肾虚大鼠的作用机制,尿样的代谢组学分析得生物标示物,进一步说明代谢组学是探究中药作用机制的重要工具。UPLC-QTOF/HDMS结合代谢组学的方法也用于大黄治疗高脂血症的研究,Chen等用UPLC-QTOF/HDMS结合代谢组学检测正常组、高脂血症模型组及大黄治疗组大鼠尿液,运用PCA和PLS-DA的分析方法,利用质谱碎片和HMD、Chemspider、KEGG等数据库,鉴别生物标示物并进行代谢途径分析,结果得生物活性物的变化和它们可能影响的代谢途径:(1)脂肪酸代谢包括硬脂酸酰胺、油酸酰胺、植物鞘氨醇;(2)氨基酸代谢包括吲哚-3-羧酸;(3)核苷酸代谢包括3-甲基尿苷;(4)能量代谢包括肌酐。谷金宁等用RRLC-QTOF/MS结合代谢组学研究人参总皂苷治疗糖尿病心肌病大鼠尿液,结果显示人参皂苷通过对三羧酸循环、脂肪酸代谢和氧化应激水平的调节,改善血脂、血糖及氧化应激水平而对糖尿病心肌大鼠起治疗作用。骨碎补提取液对骨质疏松大鼠以及肾虚大鼠尿样的UPLC-MS/MS代谢组学研究表明骨碎补通过对苯丙氨酸、脯氨酸、肌酐等7个生物标记物的影响,调节氨基酸代谢、能量代谢、肠道菌代谢等途径预防糖皮质激素性骨质疏松。Qi等基于UPLC-QTOF/MS尿代谢组学方法研究了乌头对关节炎模型大鼠的作用机制,使用正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)数据统计法得到16种潜在生物标示物,它们通过参与色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸代谢、三羧酸循环、胆汁酸的生物合成、类固醇激素的生物合成发挥疗效。

    2.2利用代谢组学研究中药复方药效作用机制

    中药复方是在中医药理论的指导下,通过辩明症候,选择药味,按照君臣佐使的配伍原则组成的复方。中药复方注重整体观念,通过复方中的多成分作用于人体的五脏六腑,不仅能够治疗主证,从整体上来调节各个相互联系的脏腑、组织、器官,同时能治疗兼证,最终起到标本兼治的目的。但目前有关中药复方疗效优势大多仅来源于临床经验的总结,经典的药理学方法运用生物化学和分子生物学技术,在化学药物的研究中也有可能发现其作用的靶点或受体,阐释其作用的机制,但很难诠释中药复方多靶点、整体性、动态性作用机制。代谢组学属于全局系统生物学研究方法,强调把人体作为一个完整的系统来研究,是基于疾病和药物干预下的系统代谢网络整体性和动态性的变化来评价中药复方的整体效应。代谢组学研究方法与中药复方治病强调整体观、辩证施治等思想相符合,中药复方的多靶点、整体性作用机制在代谢组学研究中将可能得到充分说明,对于中药复方代谢组学研究,所得代表性生物标示物见表2。

    Su等运用代谢组学结合UPLC-QTOF/MS技术,PLS-DA数据分析方法,并借助HMDB、METLIN、KEGG等数据库,分析了柴胡疏肝散对抑郁症模型大鼠作用的尿样,检测到的生物标示物及它们影响的代谢途径如下:(1)色氨酸代谢包括犬尿酸、黄尿酸、吲哚-3-羧酸等的上调或下调使得色氨酸代谢功能障碍有所恢复;(2)能量代谢包括泛酸和脯氨酸。Tan等研究四逆汤对心肌梗死大鼠的作用,大鼠尿样的代谢组学研究表明马尿酸、甘氨酸、色氨酸、肌酐等19种生物标示物通过调节心肌能量代谢,包括糖酵解、柠檬酸循环、氨基酸代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢,缓解心肌梗死。

    Liang等做了双龙方对心肌梗死作用的大鼠尿样代谢组学研究,发现双龙方可以调节三羧酸循环和磷酸戊糖途径,说明其与缓解心肌梗死和心肌能量代谢有关。在温心方对于心肌缺血大鼠模型的作用研究中,运用代谢组学结合UPLC-MS分析方法对大鼠尿样做检测,分析得到甘油酸、尿酸、硬脂酸等17种生物标示物,推测温心方通过对这些生物标示物的调节,参与糖代谢及不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸代谢而发挥治疗作用。Wang等探究了通心络对大鼠血管内皮损伤的机理,通过大鼠尿样的UPLC/MS-IT-TOF代谢组学分析发现通心络通过对吲哚酚硫酸盐、马尿酸、核黄素、对甲酚葡糖苷酸等6个生物标示物的调节,推测与腺嘌呤、苯丙氨酸、核黄素等代谢通路有关。Gou等研究了下淤血汤对四氯化碳引起的肝纤维化大鼠模型的作用,发现与调节能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢相关的10个生物标记物,为阐明下淤血汤对肝纤维化作用机理提供了一定参考。Xie等基于高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)代谢组学研究方法,发现六味地黄丸对角叉菜胶所致大鼠关节炎模型具有显著调节作用。糖尿病肾病近年来也受到广泛关注:Zhao等对中药复方知母地黄丸治疗糖尿病肾病的机理做了相关研究,从大鼠尿样的代谢组学分析可以得出,知母地黄丸通过抑制糖代谢、脂代谢,增强甲胺代谢等多条代谢通路缓解糖尿病肾病;Liu等研究了中药心可舒对家兔动脉粥样的作用,用代谢组学结合UPLC-QTOF/MS分析了家兔尿样,发现甘氨酸、马尿酸、精氨酸、谷氨酰胺、3-吲哚羧酸等15种生物标示物,它们主要通过调节柠檬酸循环、氨基酸代谢、蛋白质水解、脂肪酸代谢等代谢通路,从而改善动脉粥样硬化;Zhang等用代谢组学的方法分析了黄连解毒汤对胶原性关节炎大鼠的作用,用LC-QTOF/MS技术对大鼠尿样进行检测,得到肌酐、左旋肉碱、马尿酸、尿苷等生物标示物,它们主要对脂肪酸代谢、氨基酸代谢以及三羧酸循环产生影响。上述研究可以看出中药成分复杂,是通过对机体多条代谢途径的调节而产生作用。

    3. 利用代谢组学研究中药安全性

    中药成分复杂具有毒、效二重性,普通的研究测定单一成分或组织的方法不能很好评价中药的毒性特征及其机理,代谢组学因其高通量、灵敏度高以及特异性强的特点,已经成为阐明某些中药毒性及安全性的有效方法和途径之一。中药复方组成成分复杂,几千年的临床实践证实了显著疗效,但其毒性也不可忽视。由于中药种植环境、炮制方法、配伍应用、体内生物转化产物、生物活性和临床应用均存在多样性的特点,故更难搞清其中哪一种化学成分产生的毒副作用。复方中多味药的配伍应用使得中药复方安全性的研究既需要研究各单味中药,又需要研究各单味中药之间的配伍及其协同作用等,因此中药复方药物安全性的研究更为复杂和困难。近年来代谢组学技术已被应用于中药复方毒性作用机制研究,应用代谢组学研究方法,探查比较中药复方对不同证的作用差异,发现与毒性相关的生物标志物,对于认识中药复方药效,毒与证的关系,确保中药的安全有效使用具有重要意义。近年来国内外对中药安全性代谢组学研究所得生物标示物见表3。

    Yu等用UPLC-MS技术对泽泻组和正常对照组大鼠尿液代谢物谱进行分析测定,并对数据进行PCA以鉴别尿液中代谢产物的变化,PCA显示正常对照组和泽泻组明显分离,并发现马尿酸、肌酐、苯丙氨酸、胆酸、酮胆汁酸等11种可能与泽泻毒性有关的生物标示物,这些生物标示物通过多个代谢途径对肝、肾造成损伤。Ma等对牵牛子、黄药子的毒性进行了代谢组学研究,发现牵牛子中肌酐、苯丙氨酸、卵磷脂、植物鞘氨醇等12个可作用肾毒性标示的生物标示物,黄药子中鉴定的多个生物标示物通过推动动物机体对氨基酸代谢、能量代谢、脂肪酸代谢等代谢途径导致肝损伤。Chan等采用HPLC-TOF/MS方法研究了服用马兜铃酸后大鼠尿液的代谢图谱,发现犬尿酸和马尿酸为反映药物毒性的生物标示物,可用作评价马兜铃酸毒性的指标。Chen等采用GC-MS和LC-MS对雷公藤毒性进行研究,尿样的的分析结合大鼠肝、肾、睾丸的常规病理分析,发现雷公藤引起的毒性主要是能量代谢的失衡,如氨基酸和胆碱通路紊乱及肠道菌结构改变。Sun等研究甘草酸对乌头碱引起的中毒大鼠的解毒机理,对大鼠尿样进行代谢组学分析,鉴定亮氨酸、酪氨酸、马尿酸、肌酐等12种生物标示物,它们主要通过影响氨基酸的合成与代谢发挥解毒作用。Zhang等利用UPLC-QTOF/MS代谢组学技术和PCA和OPLS-DA的数据统计方法研究半夏的毒性机理,鉴定尿液犬尿酸、黄尿酸、泛酸、肌酐等10种生物标示物,半夏的毒理与色氨酸代谢在内的氨基酸代谢通路有关。代谢组学方法同样被用于苍耳子的毒性机理研究,尿样的代谢鉴定马尿酸、花生四烯酸、苯丙氨酸、尿苷等10种可能的毒性生物标示物,产生毒性的机理主要与脂肪酸的代谢紊乱有关。

    4. 小结与展望

    近年来,代谢组学由于其独特的性质和采用各种先进的分析技术,在单味中药和中药复方的药效作用机制及毒理方面的研究中显示出其独特的优势,在中医药研究中的应用越来越广泛。然而,代谢组学是一门新兴学科,目前的分析技术以及各种数据分析手段仍处于不断发展和逐步完善阶段。目前,代谢组学在中药现代化研究中存在以下一些值得注意的问题:(1)分析技术方面,现有的分析技术不能实现对生物体所有的代谢产物及其代谢途径的全面检测,真正意义上的定量化和系统化还难以实现,离全面的代谢组学研究目标还有一定的差距,这就向分析技术提出了更高、更严峻的挑战。(2)数据分析方面,常用偏最小二乘法(PLS)、PCA等统计分析方法,这些方法大多适用于线性数据集,如何从非线性数据中有效提取代谢物的变化规律也是代谢组学所面临的问题。(3)在代谢组学数据分析中,尽管已有几个较为常用的数据库,但是很多研究过程中发现的代谢物目前无法通过数据库进行确认。因此,代谢组学数据库需要进一步完善。(4)通过生物标示物的结构与功能分析,阐明相关生化机理和生命现象(如药理、毒理等),是未来代谢组学研究的重要方向,但目前关于中药作用机制的生物标记物及代谢通路分析均是初步、局部的,难以得到较明确的结论;对中药毒性的代谢组学研究也不是系统性的,各种毒性特征标志物的归属还有待进一步完善。(5)开展代谢组学研究所需要的检测仪器设备价格昂贵,操作人员的专业性强,对代谢组学技术的推广应用有一定的限制。

    尽管代谢组学发展中还存在一些问题需要完善和发展,但代谢组学已为中药的研究提供了崭新的思路。相信随着科学技术的发展,各种先进的代谢组学分析技术的广泛应用,代谢组学数据库的完善以及逐步实现各种组学数据的成功对接。代谢组学可以更好地用于中药现代化研究,对中药复方多靶点、整体性作用机制、复方配伍规律及安全性评价等多方面给予科学阐释,进而有力地推动中医药事业现代化的进程。 

    参考文献:略。



    [本文来源:《药物分析杂志》2016年第36卷第1期,作者授权中药大品种手机万博官网最新版本下载(BBTCML)转载编校发布。]

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